Извлечение нуклеиновых кислот — первый шаг в протоколе подготовки образцов NGS. Нуклеиновые кислоты — это большие биомолекулы, которые необходимы для всех известных форм жизни. Они состоят из нуклеотидов, которые являются мономерами, состоящими из трех компонентов — сахара, фосфата и азотистого основания. Два основных класса нуклеиновых кислот — это ДНК и РНК. Сахар РНК — рибоза, тогда как сахар ДНК — дезоксирибоза.
Диаграмма, показывающая структуру РНК (слева) и ДНК (справа). Урацил — это основание, парное с аденином в РНК, тогда как тимин парный с аденином в ДНК. Изображение предоставлено: Wikipedia
Типы выделения нуклеиновых кислот
Экстракция гуанидиния тиоцианатом-фенолом-хлороформом
После того, как клеточная структура нуклеиновой кислоты была разрушена, ДНКаза и РНКаза используются для инактивации клеточных нуклеаз. Нужные нуклеиновые кислоты затем могут быть отделены от клеточного детрита.
Фенол сам по себе является горючей, едкой и токсичной карболовой кислотой. Но смесь фенола, хлороформа и небольшого количества изоамила можно использовать для извлечения ДНК. При добавлении фенола и хлороформа к образцу образуется эмульсия, содержащая слой ДНК наверху, в результате ее гидрофильной природы. Затем ДНК можно собрать и осадить центрифугированием. Полученный осадок ДНК можно затем растворить стерильной водой.
Схема, показывающая этапы экстракции фенола и хлороформа: добавление смеси фенола и хлороформа к клеточному лизату, центрифугирование с последующей промывкой водой для получения выделенной ДНК. Изображение предоставлено: Eva Meszaros, 2021
Метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ может затем использоваться для извлечения РНК за один шаг. РНК отделяется от ДНК после извлечения с помощью кислого раствора, состоящего из гуанидинтиоцианата, ацетата натрия, фенола и хлороформа. Извлечение РНК осуществляется путем осаждения изопропанолом — это создает кислые условия, при которых РНК остается наверху смеси.
Градиентное центрифугирование хлорида цезия/бромида этидия
Градиентное центрифугирование хлорида цезия/бромида этидия применяется в исследовательских лабораториях с 1950 года. Метод основан на разнице плотностей ионов цезия и воды, а также на интеркаляции бромистого этидия для вмешательства в репликацию, транскрипцию, репарацию и рекомбинацию ДНК.
Это градиентное центрифугирование является сложным, дорогим и трудоемким методом по сравнению с другими протоколами изоляции. Он требует большого количества образца и поэтому не подходит для всех типов секвенирования. Кроме того, бромистый этидий вреден. Поэтому этот метод не используется в клинической лаборатории из-за его ограничений.
Твердофазная экстракция
Твердофазную очистку нуклеиновых кислот можно найти в большинстве коммерческих наборов для экстракции, доступных сегодня на рынке. Обычно она выполняется с использованием спин-колонки, которая работает под действием центробежной силы, что позволяет быстро и эффективно очищать ДНК. Колонку сначала необходимо подготовить для абсорбции образца, что можно сделать с помощью буфера с определенным pH. После того, как клетки были разрушены, желаемые нуклеиновые кислоты абсорбируются в колонке из-за pH связывающего раствора. Затем загрязняющие вещества удаляются путем промывки конкурентным агентом, и вводится вода для высвобождения желаемых нуклеиновых кислот из колонки.
Очистка с помощью магнитных шариков
Магнитное разделение теперь считается простым и эффективным методом, используемым для очистки нуклеиновых кислот. Это модификация твердофазной экстракции. Бусины имеют отрицательный поверхностный заряд и избирательно связываются с белками, такими как ДНК. Процесс связывания иногда может быть облегчен с помощью магнита, приложенного к стенке пробирки, поскольку это объединяет частицы вблизи стенки. Оставшуюся часть образца, состоящую из клеточного детрита и нежелательного материала, затем можно вылить. Нуклеиновые кислоты удаляются из магнитных частиц с помощью буфера, а любые оставшиеся загрязняющие вещества смываются.
Схема, демонстрирующая протокол очистки с использованием магнитных шариков. Изображение предоставлено: Andrew Gane, 2019
Этот метод, безусловно, имеет преимущества – он не требует повторного центрифугирования, вакуумной фильтрации или разделения колонок, что делает его эффективным по времени и стоимости. Доступно множество коммерческих наборов, некоторые производители даже комбинируют магнитные шарики с другими методами твердофазной экстракции, включая использование кремния. Такие технологии помогают ученым, улучшая восстановление ДНК с использованием лишь небольших объемов образца.
Get Social